即使人类对世界已如此了解，人类的好奇心千百年来仍旧只增不减。基因突变后意味着这种酿酒酵母削弱了或者失去了海藻糖的胞内合成能力。结果无法合成海藻糖的酵母在5分钟内就大量死亡，而正常积累了海藻糖的酵母在20分钟内的致死热刺激下，存活率都显著高于无法合成海藻糖的酵母。研究发现，海藻糖与水分子之间的作用力远强于水分子与水分子之间的作用力。
对于微尺度的世界，充满好奇心和窥探欲的人们从未放弃过观察。在显微镜发明前，人们就已经发现，保存起来用于酿酒接种的“酵母泥”在加热后就无法使用，推测其是一种活物，甚至已经发明了干酵母用于商业生产。光学显微镜被发明后，酵母是细胞的事实立马被观察到。随着显微镜分辨率提升，人们观察到细胞器，进一步到生物活性分子的结构和功能，推演分子之间的相互作用。甚至现在可以通过单细胞蛋白质组学，研究一个细胞在各种条件下的蛋白质表达情况，这相当于把酵母当做单个的“人”来研究。
如此繁复的研究手段层出不穷，这恰恰说明了技术的进步，是对人们探索欲望的强烈程度最直截了当的反映。即使人类对世界已如此了解，人类的好奇心千百年来仍旧只增不减。越了解，因此越想了解，放眼人类是如此，对酿酒者来说，亦是如此。若只是止步于现有的老旧书籍，或是相互抄来抄去的结论，对我来说无法得到满足，想必对你也一样。因此我整理收集十几年内最新研究结果，试图从更先进的眼光去看待这个在人类文明史上存在了几千年的古老技术过程——发酵。对我而言，这是分享，亦是向读者学习的过程。
为什么要说海藻糖？为什么要把它放在第一期来说？可能很多酿酒师见都没见过海藻糖这个词，但它对酵母来说极其重要。不如说它对生物都很重要，如果当我告诉你，这种二糖其实存在并能产生于除了脊椎动物外的几乎所有生物中时（不存在于病毒，且病毒是否是生物仍有争议），你想必能感觉到，它会是个很重要的东西。直言不讳地说，干酵母之所以能做成“干的”，就是因为有海藻糖。人稍微缺点水很快就会休克甚至死亡，酵母没水了为啥还能“活着”？在这个人人都用干酵母的时代，理解海藻糖的作用，也是理解你手心里那包干酵母的第一步。
什么是海藻糖？有啥用？海藻糖，一种非还原二糖，是由两个葡萄糖通过α-1,1-糖苷键连接而成的化合物。就化学性质而言，海藻糖比较稳定，没有还原性，耐酸性水解，在溶液状态下，高温也具有稳定性，无法与蛋白质中的赖氨酸、丝氨酸残基发生糖化反应（glycation），并且能形成分子间氢键。在生物上，它除了作为一种二糖来提供能量以外，还有一个十分重要的作用，就是帮助生物克服极端环境而生存下来！那酵母又是如何利用海藻糖的呢？
海藻糖分子 | Nutrientsreview.com
作为酿酒师，大家可能或多或少听过，酵母在发酵过程中会面对环境不利条件。在酵母面临来自环境不利条件的情况下，最明显的特征是发酵减缓，同时可能会产生许多不想要的发酵副产物，比如双乙酰，硫化物等等。
发酵过程中的酵母面对的不利条件有哪些？温度过低或过高，糖度太高，酒精度太高，氧化压力大，缺乏糖分、维生素、矿物质等营养等等。在这些不良外界条件下，海藻糖都可以对酵母细胞进行有效保护，因此人们把酵母细胞内的海藻糖含量作为一个酵母当下所受环境不利条件状态的指标，来衡量酵母受压情况。接下来有个有趣的研究内容，拿出来和大家分享一下。
高温下海藻糖对细胞的保护作用：
酿过酒的朋友都知道，艾尔系列的酿酒酵母一般的活化温度是20-40℃左右，一般认为超过40℃酵母就“死亡”了。但早在1993年，瑞士科学家Claudio DE VIRGILIO就通过实验证明了酵母在高温下没那么脆弱。这是一个什么实验呢？
高温下酵母细胞存活率 | European Journal of Biochemistry
研究者制作了一种Tps1 基因突变的酿酒酵母，这个基因是海藻糖合成酶蛋白复合体的关键蛋白质之一。基因突变后意味着这种酿酒酵母削弱了或者失去了海藻糖的胞内合成能力。
研究者将正常表型的酿酒酵母与Tps1 基因突变的酿酒酵母在平台期培养三天时间，以刺激细胞合成并积累海藻糖，再将两种酵母放置在致死温度下54℃下培养20分钟，将不同细胞的存活率制作成上图的曲线（实心圆圈是正常表型的酿酒酵母，空心圆圈是Tps1 基因突变的酿酒酵母）。结果无法合成海藻糖的酵母在5分钟内就大量死亡，而正常积累了海藻糖的酵母在20分钟内的致死热刺激下，存活率都显著高于无法合成海藻糖的酵母。
这个实验虽然设计很简单，但反应的结果很有趣：海藻糖能帮助酵母对抗环境中的热刺激，即使这个热温度远远超过了商用干酵母活化温度的上限40℃，酵母也不会立刻死亡。
随着科技水平的发展，人们已经有能力深入理解海藻糖保护作用的机制原理。目前已知的理论模型有三种，分别对应不同的应用场景。
I：抗氧化保护
大家都知道酒花容易被氧化，酒花中的香气物质主要以萜类为主，萜是一种烯烃，具有C=C双键。酒花的香气成分极易被氧化的原因，就是C=C双键容易被氧化。神奇的海藻糖却能结合在C=C双键的位点，在空间上隔离了氧气分子与C=C双键的直接接触，达到了抗氧化的作用。
以不饱和脂肪酸亚油酸为例：
亚油酸结构 | Journal of the American Chemical Society
海藻糖与亚油酸分子间相互作用 | Journal of the American Chemical Society
一分子的海藻糖结合一个双键，将双键包围起来，不给氧气分子可趁之机。上图展示的就是亚油酸C9, C10双键及C12, C13双键被上方两个分子的海藻糖包围的分子比例模型。
II: 玻璃化理论（Virtrification）
玻璃化指的是将液态物质转化成非晶固体。这个理论来源于人们对于冷冻保存细胞组织的需求，大家都知道水在低于0℃时会结冰，缓慢的结冰是一个水结晶的过程，即水分子通过氢键形成规则排列最后形成晶体的过程，对于细胞组织来说，这些尖锐的晶体会轻易地刺破细胞膜，导致升温后细胞内容物外流而死亡，这叫做冷冻损伤。
对人类组织是如此，对于单细胞生物酵母来说也一样如此。研究发现，海藻糖与水分子之间的作用力远强于水分子与水分子之间的作用力。由于海藻糖分子量较大，且能够增加液体粘度及降低凝固点，同时和水分子间能形成稳固氢键，因此海藻糖可以让水在冷却固化的过程中不聚集形成晶体，而是围绕在均匀分布的海藻糖周围，形成像玻璃一样的非晶固体，直接将当前的液体塑型，这样细胞就被以原本的形状保存下来，细胞也不会因为冷冻而造成损伤，冷冻仅仅是大大降低了代谢活力而已。
结冰肾脏与玻璃化冷冻肾脏对比 | alcor.org
III：水置换理论
水置换理论指的是，海藻糖通过取代生物大分子周围的水分子，形成海藻糖-生物大分子氢键，来保持生物大分子的活性结构不被破坏。
比如溶解在细胞质中的蛋白质分子，在无压力情况下，细胞内没有海藻糖存在，蛋白质直接与水接触，溶解在水中的底物分子，如葡萄糖就有机会接触到己糖激酶来进行磷酸化反应，而后被与其他蛋白酶接触而进一步分解产生能量。
但如果酵母感受到外界压力，在胞内产生大量海藻糖，海藻糖由于氢键形成能力强，取代了己糖激酶表面的水，将其封锁起来无法解除到水环境，也就无法接触到葡萄糖分子，因此对葡萄糖分子的代谢也就停滞了，同时己糖激酶也被保护了起来，相当于将其与环境隔离。
类似的，细胞膜的内外表面，脂双层的亲水端周围的水环境，也很容易被海藻糖取代，进而达到稳定结构与隔离的作用，将细胞与外界的不利环境直接隔离保护。
水置换理论示意图 | Protein Science
海藻糖的这种保护作用有多强？用我自己亲历的例子或许可以说明。有次在和小伙伴酿酒的过程中，小伙伴不慎把干酵母丢在了接近60℃的水里，过了一个小时发现酵母还没活化“起泡”，我们又苦等了近两个小时，还是什么反应都没有。当时小伙伴认为酵母可能全“死了”，但我们抱着试试看的心态把这锅死“酵母”投进了发酵罐。
过了24小时，麦汁一点发酵现象都没有，发酵罐里一片风平浪静，麦汁表面也没有发酵酵母形成的泡沫。但再等了12小时左右，我们发现发酵罐里剧烈的发酵开始了，而且根据几天的观察，发现降糖速度一点也不比平常正常活化的酵母差，可见最终具有发酵活力的细胞数没有差太多，只是因为热刺激的原因，酵母的迟滞期变得非常长，长时间处在受激后可怜巴巴的“自闭”状态，而非死亡。受限于监测设备，我们没法测得整个过程中溶解氧的变化，如果能测得溶解氧的变化曲线，就更能说明问题了。
有朋友就疑惑了，不是说有海藻糖才能让酵母耐高温吗？商用干酵母里一定就有海藻糖吗？没错，不光有，还很多。研究表明，酵母细胞海藻糖的含量水平是能否产生具有活性干酵母的关键因素，因为海藻糖能在酵母制干过程中提供直接保护，而海藻糖分泌不足的酵母无法被制成干酵母。 那么，下一个问题来了。
这其实对于好奇酵母对抗极端环境的科学家们来说，是个疑惑了他们几十年的问题。得益于科技进步以及大家的不懈努力，酵母的海藻糖代谢模型在建立后不断完善。到如今，大家已然能比较清晰地看待酵母的海藻糖代谢过程。
海藻糖在酵母面对压力(所处环境里的不利条件）时产生
无压力状态下酵母海藻糖代谢 | Current Genetics
无压力状态下，TPS 复合体（Trehalose-6-phosphate Synthase Complex 海藻糖-6-磷酸合成酶复合体）不完整，导致胞内的海藻糖合成停止，且葡萄糖代谢产物G6P（葡萄糖-6-磷酸）和UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）共同抑制TPS复合体基因表达。同时，胞内的海藻糖水解酶Nth1（Neutral Trehalose Hydrolase 1）处于磷酸化激活状态，会分解胞内任何存在的海藻糖。同时用于分解膜外海藻糖的海藻糖水解酶Ath1（Acidic Trehalose Hydrolase 1）处于液泡中，未被释放到细胞外，处于待命状态。
压力状态下酵母海藻糖代谢 | Current Genetics
压力状态下，TPS复合体激活，胞内产生大量海藻糖，胞内的海藻糖水解酶Nth1被去磷酸化，因此失活而无法分解胞内大量堆积的海藻糖。α-葡糖苷转运蛋白Agt1（α-glucoside transporter I）将胞内积累的海藻糖运至膜外，在膜外取代水分子，结合磷脂上的磷酸基团以稳定细胞膜的温度抗性，以及提供细胞膜的隔离保护。而在这种状况下，胞内的代谢水平下调，整体细胞准备进入休眠状态以度过恶劣环境的难关。
压力消失状态下酵母海藻糖代谢 | Current Genetics
压力消失状态下，酵母必须争分夺秒地快速进入良好的代谢状态，因此胞内外的海藻糖必须快速被分解。此时胞内的海藻糖水解酶Nth1被迅速磷酸化而开始分解胞内海藻糖，储存在小液泡中的海藻糖水解酶Ath1也被转运至膜外开始清理结合在细胞膜外的海藻糖。海藻糖被降解生成大量葡萄糖，葡萄糖代谢产生的G6P和UDPG也增多，抑制TPS复合体活性，抑制其利用胞内葡萄糖合成海藻糖。在这种调节机制下，酵母能迅速对外界环境改变做出反应，以达到快速适应的目的。
总之，酵母处于压力环境下，海藻糖能保护细胞的活性。但另一方面，它也降低了生物反应活性。比如高温下取代水结合蛋白质以保护蛋白质，部分蛋白质因此也丧失与底物结合的机会，导致功能性蛋白进入一种休眠状态，这也是为什么酵母处在压力环境下反映出发酵迟缓的原因之一。
海藻糖的第二功能：海藻糖还有一个作用是储能，然而这个功能也只能算的上是主要功能的副产物，即降解后产生葡萄糖用于糖代谢。作为一种储能物质对比糖原远不够优秀，不仅增加渗透压，还会降低胞内活性，结果就是让处在营养丰富环境下的酵母因为积累海藻糖而无法继续吸收营养增殖，与生物繁殖目的相违背。
1. 干酵母状态下的酵母是一种什么情形，我们为何需要活化？
干酵母状态下，酵母胞内外被海藻糖保护，代谢活力极其低下，因此需要一定时间活化，让酵母吸收代谢这些海藻糖，让生物分子恢复活性。
2. 为什么高浓度麦汁的酵母需要活化？
因为高浓度麦汁对于酵母是一种外界压力（不良条件），干酵母本身一方面在高渗溶液中难以吸水活化，另一方面也不愿意面对压力（不良条件）恢复活力，因此需要让酵母先在舒服的环境中活化后，再加入麦汁中，防止部分酵母无法激活的情况，以至于出现发酵缓慢，代谢副产物多的情况出现。
3. 为什么高浓度麦汁发酵逐步加糖发酵速度更快？
控制麦汁浓度，也就是控制外界不良压力（不良条件），对于健康发酵，保持酵母高生物活性有益，故而发酵速度更快。
写在最后
如此重要的一种物质，为什么酿酒的专业书中提及甚少？并不是因为发现晚，而是很显然，如果只是单纯酿酒，走完酿酒的流程，做好麦汁后一股脑地交给酵母去发酵而言，海藻糖的理论知识对于这样的酿造工艺而言就可有可无。我还记得最开始进入这个行业见到的一句话，“最好的酿酒师能够酿出和自己设计一致的酒”，而无与伦比的精确控制背后除了经验，当然还需要超越常人的理解。
